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前沿熱點(diǎn)

如何識別并避免免疫分析中的干擾?

2023-10-10 - 市場(chǎng)部

免疫分析法是使用抗體檢測不同物質(zhì)的實(shí)驗分析方法。它們通常用于生命科學(xué)行業(yè)的生物分析和生化實(shí)驗室。這些方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、酶免疫分析(EIA)、免疫印跡 (WB)、放射免疫分析(RIA)、蛋白質(zhì)陣列、免疫組化(IHC)或免疫聚合酶鏈反應(Immuno-PCR)。在各種免疫分析法中,待測物的檢測都可能受到干擾的影響。經(jīng)常發(fā)生交叉反應、非特異性結合和基質(zhì)效應。干擾物質(zhì)在真實(shí)標本中以或多或少的顯著(zhù)濃度水平存在,并與待測物或捕獲檢測抗體相互作用。通過(guò)使用一種新的緩沖液(Lowcross-Buffer),替代傳統緩沖液,大多數干擾影響都可以避免。通過(guò)這種替換,提高了分析方法的質(zhì)量和分析方法開(kāi)發(fā)的效率。

 

尼爾斯·杰尼因其在免疫系統的構建和控制特異性方面的貢獻獲得1984年諾貝爾醫學(xué)獎,他在頒獎演講中提到,每一種抗體都是多特異性的。他將這一說(shuō)法與免疫反應早期階段的抗體產(chǎn)生聯(lián)系起來(lái)。與目標分析物具有高親和力的抗體偶爾會(huì )顯示出令人驚訝的結果:在包被捕獲抗體的免疫檢測中,免疫印跡膜中不必要的條帶被染色,蛋白質(zhì)陣列上得到錯誤斑點(diǎn)的熒光信號以及空白樣本的高背景信號。ELISA檢測中,得到陰性信號的高背景或假陰性結果。由于干擾效應造成的錯誤結果可能導致后續成本浪費和錯誤診斷。

所有的免疫分析方法的特征是在目標分析物和抗體之間的結合反應。這些方法存在的問(wèn)題是經(jīng)常發(fā)生的干擾,導致了錯誤的檢測,這個(gè)問(wèn)題至今未得到充分地解決。典型的干擾非特異性結合,導致較差的信噪比和高背景, 交叉反應和基質(zhì)效應。簡(jiǎn)單地說(shuō),這些效應大多是基于分析物、捕獲抗體或檢測抗體與外部物質(zhì)或表面的直接相互作用。圖1表示了一種典型干擾效應的簡(jiǎn)化方案。在技術(shù)文獻中經(jīng)常被描述的已知的干擾因素如異嗜性抗體和HAMAs(人抗小鼠抗體)、類(lèi)風(fēng)濕性因子、白蛋白、補體,溶菌酶以及其他等。

 

免疫分析標記帶來(lái)的干擾

在免疫分析中標記檢測抗體非常常見(jiàn),譬如在競爭法中,標記待測分析物。經(jīng)常使用的標記有酶(堿性磷酸酶或辣根)過(guò)氧化物酶)、熒光染料、放射性同位素或DNA(用于免疫PCR)。不必要的影響也出現在這里。危險在于,使用熒光染料作為標記,這類(lèi)疏水染料會(huì )改變檢測抗體的結合能力,導致染料本身的非期望的結合,且降低了標記 蛋白的溶解度。此外,抗原與抗體的結合也會(huì )變弱。例如,這些非特異性效應會(huì )導致抗體與表面(1AB)、與樣品中的外部蛋白質(zhì)(1C)或對捕獲抗體(1D)的結合增加。在這些情況下,會(huì )導致在沒(méi)有分析物存在時(shí)出現假陽(yáng)性或整個(gè)檢測出現高背景。在蛋白質(zhì)芯片上觀(guān)察到單個(gè)斑點(diǎn)的背景熒光增加,或信噪比完全變糟糕。同樣,血清樣本中的蛋白質(zhì)或抗體也可以與熒光染料結合,減少甚至封閉染料的熒光。因此,一些研究人員已經(jīng)建議放棄熒光染料作為蛋白質(zhì)陣列的標記或選擇其他標記。蛋白質(zhì)芯片上的反應是非常復雜的,因為在一個(gè)反應體系中同時(shí)使多種不同的捕獲抗體和標記的檢測抗體。因此,樣本中蛋白質(zhì)或標記抗體與單點(diǎn)的非特異性結合的概率升高, 同時(shí)樣本中成分與抗體的結合帶來(lái)的干擾效應也隨之增加。

 

交叉反應帶來(lái)的干擾

交叉反應是指抗體也與目標分析物以外的其他結構結合的能力(1, I-K)。通常這些結構與被分析物有很大的相似性。因此,具有相似分子結構的代謝物或化學(xué)物質(zhì)就是例子。氨基酸序列具有巧合相似性或同源性的蛋白質(zhì)也會(huì )發(fā)生交叉反應。特別是在競爭分析中,因為只是用了一種抗體,交叉反應發(fā)揮更大的作用。為了確認此類(lèi)分析,對經(jīng)??赡馨l(fā)生的交叉反應物質(zhì)和交叉反應需要被量化。

交叉反應也可以在蛋白印跡檢測或免疫組化實(shí)驗中發(fā)揮重要作用。盡管人們不知道在每種情況下,這些不必要的結合的確切分子機制,交叉反應在其他條帶或細胞結構的染色中變得很明顯。在蛋白印跡檢測中,人們假設在許多情況下降解正確蛋白質(zhì)的產(chǎn)物是自然的或合理的方式造成的。但在某些情況下,這并不是事實(shí),我們需要考慮一抗或二抗的交叉反應。

 

 

1: 在免疫分析中可能出現的不同干擾效應的示意圖。

A: 標記的檢測抗體與未封閉的表面的非特異性結合。結果是假陽(yáng)性信號。

B: 標記的檢測抗體與封閉表面的非特異性結合。盡管表面被封閉,但抗體與封閉蛋白相結合。結果是假陽(yáng)性信號。

C: 干擾蛋白與檢測抗體的Fc片段結合,并在空間上阻礙待測物的結合。結果是假陰性信號。

D: 捕獲抗體與檢測抗體的Fc片段結合。結果是假陽(yáng)性信號。待檢測物不能再與捕獲抗體結合。

E: 不受影響的試驗,沒(méi)有任何干擾。理想的狀態(tài)。

F: 通過(guò)異嗜性抗體或HAMAs進(jìn)行的橋接結合。通過(guò)此方法,捕獲抗體與檢測抗體連接,從而產(chǎn)生假陽(yáng)性信號。

G: 一種與捕獲抗體具有抗獨特型結合特性的HAMA。干擾抗體結合在捕獲抗體Fab片段的高度可變區域,從而阻止了待測物的結合。因此,就會(huì )出現假陰性信號。

H:一種與檢測抗體具有抗獨特型結合特性的HAMA。干擾抗體結合在檢測抗體Fab片段的高度可變區域,并阻止待測物的結合。結果,出現了假陰性信號。

I:干擾物質(zhì)與捕獲抗體的交叉反應性。結果是假陰性信號。

J:干擾物質(zhì)與檢測抗體的交叉反應性。結果是假陰性信號。

K:與捕獲抗體和與檢測抗體的交叉反應性。這種現象在實(shí)踐中很少出現,這種抗體的特異性肯定較低。這種干擾現象也可以發(fā)生在待測物具有蛋白質(zhì)保守氨基酸序列,該序列也出現在其他蛋白質(zhì)上。

L:樣本中的其他蛋白質(zhì)掩蔽待測物,使其表位被封閉,無(wú)法與捕獲抗體結合,或空間位阻情況嚴重。結果是假陰性信號。

 

非特異性結合帶來(lái)的干擾

與交叉反應密切相關(guān)的是非特異性結合。然而,兩者在分子水平上的機理有所不同。在日常的實(shí)驗室工作中, 這些差異不明顯。交叉反應中,造成交叉反應的物質(zhì)是已知的,并且它的交叉反應性可以定量,譬如與交叉反應物的濃度競爭關(guān)系。而在非特異性結合的情況下,結合涉及的物質(zhì), 遠遠超過(guò)目標分析物(如與白蛋白或免疫球蛋白的非特異性結合)或與表面(ELISA孔或免疫印跡膜表面)或蛋白質(zhì)芯片中的固定抗體斑點(diǎn)。

 

基質(zhì)效應

基質(zhì)效應是樣本中所含成分帶來(lái)的干擾效應的總和,影響目標分析物的檢測。如果產(chǎn)生干擾真正分子原因還沒(méi)有確定,但人們知道它來(lái)自于樣本,那么一般就稱(chēng)之為基質(zhì)效應。從一種效應到另一種效應的邊界是不固定的,有時(shí)并不清晰。一些基質(zhì)效應來(lái)自抗動(dòng)物抗體,另一些來(lái)自異嗜性抗體,或來(lái)自?xún)仍葱愿蓴_,或僅僅來(lái)自粘度、ph值或僅僅來(lái)自鹽濃度。

 

抗動(dòng)物抗體產(chǎn)生的干擾

人抗動(dòng)物抗體(HAAA)可為IgG-、IgA、IgMIgE型。它們是免疫系統應答的一部分,與動(dòng)物來(lái)源的免疫球蛋白結合。HAAAs在許多診斷性免疫分析中是眾所周知的干擾物,有時(shí)可能是80%臨床標本的一部分——取決于具體應用研究。HAAAs的濃度最高可達每毫升數毫克。

人抗小鼠抗體(HAMA)是免疫分析中最常見(jiàn)的干擾抗體。HAMAs人類(lèi)抗體,具有顯著(zhù)的特異性,有時(shí)具有明顯的小鼠抗體親和力?;颊唧w內產(chǎn)生這些抗體的原因通常是使用治療性抗體藥物治療癌癥而產(chǎn)生。用藥后,患者的免疫系統會(huì )對這些外源性抗體產(chǎn)生反應,形成針對治療性小鼠抗體的自身抗體。因此,如果免疫分析中使用小鼠抗體作為分析試劑, HAMAs會(huì )干擾免疫檢測結果。在使用小鼠單克隆抗體的夾心法分析中,這可 以導致捕獲抗體和檢測抗體之間的直接結合,而無(wú)需任何分析物(1F)。這會(huì )導致假陽(yáng)性信號。來(lái)自不同物種的抗體序列有相似之處。這意味著(zhù),含HAMAs的血清也可能會(huì )在使用來(lái)自其他物種的抗體的檢測中產(chǎn)生問(wèn)題,并產(chǎn)生同樣的錯誤信號結果。

HAMAs不僅來(lái)源于抗體治療,長(cháng)期接觸家畜和寵物,最終也會(huì )形成針對這些動(dòng)物的抗體。有人在患者的血清中發(fā)現了針對兔子、老鼠、狗、倉鼠的抗體。這些抗動(dòng)物抗體干擾了一些具有不同親和力和不同問(wèn)題的檢測抗體。一些干擾抗體不僅針對檢測抗體的Fc片段,也針對檢測抗體的Fab片段。這可能導致正確結合減少或完全阻礙,從而導致假陰性信號(1GH)。如果HAAAsFc片段結合,它們被稱(chēng)為抗同型干擾。如果它們結合到高度可變的Fab片段上,它們就被稱(chēng)為抗獨特型干擾。

 

異嗜性抗體帶來(lái)的干擾

泰伯醫學(xué)詞典將異嗜性抗體定義為與特定抗原以外的其他抗原結合的抗體。異型抗體可為IgG、IgA、IgMIgE型。特別是IgM型在風(fēng)濕病患者的血清中起著(zhù)特殊的作用。這些血清中含有高濃度的所謂類(lèi)風(fēng)濕性因子。類(lèi)風(fēng)濕性因子IgM抗體,可與人類(lèi)抗體的Fc部分結合,因此也與實(shí)驗中使用的抗體的Fc部分結合,且與物種無(wú)關(guān)。因此,風(fēng)濕病血清將捕獲與檢測抗體連接起來(lái),導致假陽(yáng)性結果。這同時(shí)也是異嗜性抗體的一般干擾機制。風(fēng)濕病血清的效應類(lèi)似于HAAAs的效應。與HAAAs相比的區別在于異嗜性抗體的來(lái)源,他們不是建立在與動(dòng)物免疫球蛋白反應的基礎上,而是早期免疫應答的多特異性抗體或來(lái)源不明的干擾性抗體。

HAAAs或異嗜性抗體造成的干擾被發(fā)現已有30多年。干擾抗體是來(lái)自動(dòng)物源的一般弱結合抗體,主要干擾由于分析物濃度低,血清或血漿樣本需低稀釋度稀釋的分析。向樣本緩沖液中添加阻斷物——通常是非特異性血清、抗體片段或高濃度的動(dòng)物免疫球蛋白——能夠通過(guò)競爭減少HAAAs或異嗜性抗體的干擾效應,但不能完全避免。

 

樣品內源性物質(zhì)帶來(lái)的干擾

即使是標本中天然存在的蛋白質(zhì)也會(huì )干擾免疫分析。人血清中眾所周知的干擾物質(zhì)有白蛋白、補體、溶菌酶和纖維蛋白原。低分子量的分析物可以與白蛋白結合,這使得抗體與分析物的結合變得困難。許多激素都與轉運蛋 結合,這也可能為免疫分析帶來(lái)困難。此外,許多蛋白質(zhì)具有結合其他物質(zhì)和蛋白質(zhì)的能力。這種結合能力通常是各自蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的重要組成部分。白蛋白、補體和C反應蛋白(CRP) 是多種物質(zhì)的天然受體。因此,非特異性結合甚至交叉反應——如與抗體的反一樣——都是可能發(fā)生的。這使得在免疫檢測中識別某些分析物變得復雜。內源性 蛋白可以作為一種干擾因子與抗體結合(1C,I-K)或掩蔽目標分析物(1L)。例如,溶菌酶能非特異性地與具有低等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)結合。因此,低等電點(diǎn)5的抗體可以與之結合,并在捕獲抗體和檢測抗體之間建立橋梁。需要提到的一個(gè)重要方面是,含有大量脂質(zhì)的標本的干擾,因為一些分析物是脂溶性的,且抗體與分析物之間的結合可能也會(huì )受到脂質(zhì)的影響。

 

鉤狀效應

鉤狀效會(huì )導致假陰性結果,但與其他干擾效應不同的是,它不是通過(guò)與干擾因素的相互作用而產(chǎn)生。

免疫分析時(shí),當樣本與分析抗體直接混合,且分析物的濃度非常高時(shí),鉤狀效應就有可能發(fā)生。在這種情況下,當分析物的高濃度超過(guò)分析抗體的濃度時(shí), 捕獲抗體和檢測抗體會(huì )出現飽和。因此高濃度被判讀為遠低于實(shí)際的低濃度, 從而導致對真實(shí)濃度的顯著(zhù)低估。在實(shí)踐中,通過(guò)使用更高濃度的檢測抗體或者稀釋樣本,可以避免鉤狀效應?;蛘?,必須對實(shí)驗進(jìn)行系統化稀釋?zhuān)源_保檢測值不受鉤狀效應的影響。已知的可能受到鉤狀效應影響的臨床參數有: CRP、AFP、CA125、PSA、鐵蛋白、催乳素及TSH等。

 

使用LowCross Buffer®防止干擾

造成所描述的干擾效應的原因是相似的。干擾因子與抗體或分析物之間存在不必要的從低到中的親和作用。標記抗體與其他蛋白質(zhì)或表面的低親和力結合或中親和力結合,同樣抗體與結構相關(guān)物質(zhì)低到中親和交叉反應。LowCross Buffer®利用了這些干擾效應的共同之處:干擾反應弱于真實(shí)分析物的特異性結合。當然,很少有發(fā)生非常高的親和交叉反應,達到與真正特定結合相同的結果。在這種情況下, 人們必須談?wù)撘粋€(gè)特定的結合,并且在原則上有一個(gè)針對兩種不同物質(zhì)的抗體。因此,這種抗體根本不能用于特定的分析。Low Cross Buffer® 是專(zhuān)門(mén)開(kāi)發(fā)來(lái)消除低和中親和力結合,但不會(huì )對高特異性的高親和力結合產(chǎn)生任何負面影響。

2到圖5顯示使用LowCross Buffer®防止免疫分析中典型的干擾效應的不同示例。圖2顯示了蛋白芯片應用中使用LowCross Buffer®降低高背景,并將信噪比從3.4提高到17.3。在這個(gè)實(shí)驗中,對不同多克隆抗EPIL抗體(EPIL=早期胎盤(pán)胰島素樣生長(cháng)因子) 的適用性進(jìn)行了測試??贵w使用濃度為500µg/ml、體積為1.8 nl/spot通過(guò)生物芯片打點(diǎn)機(GMS 417)固定在氨基硅烷化的微陣列載玻片上。隨后,將2mlEPIL過(guò)度表達細胞系(SKBR3) 培養基與染料Oyster650P混合,此時(shí)培養基內蛋白質(zhì)被標記。分別使用LowCross Buffer®PBS按照120稀釋培養基,加在載玻片上進(jìn)行孵育。沖洗載玻片后,用熒光掃描儀(GMS 418進(jìn)行讀取,并用ImaGene分析數據。通過(guò)使用LowCross Buffer®可以明顯降低背景信號,從而使得更好地區分單個(gè)抗體是否適用于檢測EPIL。

2: 減少檢測抗體與蛋白質(zhì)芯片表面的非特異性結合。通過(guò)使用LowCross-Buffer®,將信噪比從3.4提高到17.3。(數據源自N. Dankbar, university of Münster)

 

3顯示用westen blotting法檢測來(lái)自肝細胞和HeLa細胞的角蛋白4、5 6,其中通過(guò)交叉反應非特異性結合檢測到比正確條帶更多的條帶。蛋白質(zhì)樣品在12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳跑樣,然后印跡到硝基纖維素膜上。蛋白質(zhì)樣本中的細胞角蛋白的westen blotting檢測方法采用改進(jìn)的標準流程??辜毎堑鞍卓贵w用LowCross Buffer® TTBSTween- Tris緩沖鹽水)按照12500比例稀釋?zhuān)脡A性磷酸酶標記的二抗進(jìn)行檢測(二抗用LowCross緩沖液®TTBS 按照11250比例進(jìn)行稀釋?zhuān)?,再加入底?/font>BCIP/NBT顯色。如果沒(méi)有LowCross Buffer®的幫助, 很難揭示非特異性結合反應的確切分子原因。由于其他細胞角蛋白及其裂解產(chǎn)物或與肝臟或HeLa細胞的細胞破裂產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)的非特異性結合,可能導致交叉反應發(fā)生。用LowCross buffer®替換TTBS,稀釋一抗和二抗,可以將非必要的結合減少,細胞角蛋白只在56 -60kDa的正確分子量區域內被染色。

3: Western blotting法檢測細胞角蛋白4、56。圖中顯示了實(shí)驗中使用LowCross Buffer®TTBS檢測的效果對比。LowCross Buffer® 可以完全防止不必要的結合。細胞角蛋白4、5656-60kDa之間,使用LowCross Buffer® 可清晰地被檢測到。泳道11'樣本來(lái)自肝細胞,泳道22'樣本來(lái)自Hela胞。M為分子量marker,用酰胺黑染色。印跡膜是硝酸纖維素膜porablot NCP。

 

4 顯示了基質(zhì)效應如何影響ELISA。通過(guò)這種模型分析(由Candor Bioscience公司開(kāi)發(fā)),系統地誘導了基質(zhì)效應。用兔血清作為基質(zhì),加入一定濃度的C反應蛋白。使用捕獲抗體(clone C2,1 µg/ml))生物素化檢測抗體(clone C6, 2 µg/ml。加入的血清樣品分別用PBS-BSA緩沖液或LowCross-Buffer®按照12進(jìn)行稀釋?zhuān)?/font>ELISA檢測。通過(guò)加入辣根過(guò)氧化物酶結合物及TMB底物進(jìn)行檢測。

4:ELISA法檢測家兔血清中的CRP。 LowCross-Buffer®通過(guò)去除基質(zhì)效應來(lái)提高靈敏度。

 

基質(zhì)效應的確切分子基質(zhì)未知,它會(huì )導致校準曲線(xiàn)的靈敏度差。CRP蛋白由于其生理特征,能夠結合許多蛋白質(zhì)和其他物質(zhì),可能顯著(zhù)降低表位的可用性。雖然不能排除1(I-L)中所示的干擾效應發(fā)生的可能,但大概率會(huì )發(fā)生圖1(L)所示的干擾效應。LowCross Buffer®可防止CRP與兔血清內源性物質(zhì)結合,從而將校準曲線(xiàn)的靈敏度提高3倍。

5是用于豚鼠免疫毒理學(xué)研究的抗豚鼠免疫球蛋白的ELISA示例。在本試驗中,特異性對照(A1-A12行)和空白值(H1-H12)的假陽(yáng)性結合破壞了數據評估。LowCross Buffer®的使用防止了假陽(yáng)性信號,而且使BG1-6BG7-12的濃度檢測成為可能。使用山羊抗豚鼠IgG Fab'2作為捕獲抗體,并使用生物素化的山羊抗豚鼠IgGFcγ)作為檢測抗體。豚鼠IgGLowCross Buffer®PBS進(jìn)行稀釋。PBS-BSA緩沖液用作封閉緩沖液。用鏈霉親和素過(guò)氧化物酶和鄰苯二胺進(jìn)行檢測。

5: 在用豚鼠IgG進(jìn)行ELISA實(shí)驗中,通過(guò)使用LowCross-Buffer®防止假陽(yáng)性結合(A1- 12行為對照組,H1-12為空白組。

 

結論

免疫分析中用于生物分析和診斷目的的抗體的使用,同時(shí)伴隨著(zhù)干擾現象的產(chǎn)生。在過(guò)去30趙成成干擾的多種分子機制被發(fā)現,人們對其進(jìn)行評估,從而制定預防策略。在當今的技術(shù)發(fā)展水平上,許多干擾影響都可以最小化,而LowCross Buffer®對此做出了重要貢獻。LowCross Buffer®可使不同分子原理的不同干擾效應最小化,適用于不同的免疫分析。此外,LowCross Buffer® 還可以防止HAMAs類(lèi)風(fēng)濕性因子的干擾效應、免疫組織化學(xué)應用中的非特異性結合以及免疫PCR中的假陽(yáng)性條帶??傊?,優(yōu)化實(shí)驗所需的時(shí)間和成本可以大大減少和簡(jiǎn)化,同時(shí)提高可靠性。

 

相關(guān)產(chǎn)品推薦

Candor Bioscience   100500 LowCross Buffer

Candor Bioscience   180500 Assay defender

 

獻引用

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